用TE(pH8.0)重悬细胞至5X个/mL,转移至-一个锥形烧瓶中。1mL细胞悬液用50mL锥瓶,2mL细胞悬液用mL锥瓶,余者类推。
单层培养细胞的密度因细胞类型和培养条件而异,仅凭经验而言,长满90mm培养皿(如HeLa或BHK细胞)细胞密度大约为1X10*~3X个/em2
vi.每毫升细胞悬液加10mL裂解缓冲液,37C孵育Ih,立即进行步骤2。确保加入裂解液时,细胞悬液均匀地分散在锥瓶内表面,以使形成难以处理的DNA团块的可能性降到最低。
让天忏个的衣肝因为组织中通常含有大量的纤维物质,难以提取高产量的基因组DNA.在裂解之前将组织粉碎可极大地提高抽提效率。大量的新鲜组织(1g)可以用Waring混合器来粉碎。
附加材料:烧杯、液氮、聚丙烯离心管(50mL;Falcon或相当产品)Waring混合器配备不锈钢杯或用液氮预冷的研钵和研杵预冷研钵必须缓慢加入少量液氮,突然将液氮注满研钵或将研杵浸入液氮会发生碎裂。将研钵置于冰上并加入干冰不失为--种在加入液氮前预冷的好办法。
研磨人类和灵长类动物的组织时要小心,因为容易产生粉末气溶胶,尤其是:当加入液氮时。
1.粉碎组织。
i.将1g新鲜切除的组织样品置于盛有液氮Waring混合器的不锈钢杯中,以最高速度将组织磨成粉末。小量组织样品可在液氮中快速冷冻,并用液氨预冷的研钵和研杵研磨。
ii.液氮挥发,将粉末状的组织加入到盛有10倍体积的裂解液的烧杯中,使其分散于裂解液表面,然后摇动烧杯将粉末浸没。