前言
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高致死率的癌症，预后不佳。由于高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME），免疫疗法不能改善PDAC患者的临床表现。而有研究表明，肠道菌群可以决定癌症的进展和免疫治疗反应，比如来自长期PDAC患者（可能具有一定的抗肿瘤因子参与）的肠道菌群具有一定的抗肿瘤作用。这种抗肿瘤作用可能与TME的免疫反应有关。肠道菌群可以产生多种代谢物，比如促炎代谢物氧化三甲胺（TMAO），由食物中胆碱经肠道菌的胆碱TMA裂解酶转化为TMA，而后TMA进入门静脉，在肝脏中氧化为TMAO。研究表明，TMAO可以激活免疫。因此，本篇作者采用多组学的方法对TMAO抗肿瘤的效果及机制展开研究。
年9月,费城Wistar研究所的RahulS.Shinde团队在ScienceImmunology（IF：30.63）发表了题为“Themicrobiome-derivedmetaboliteTMAOdrivesimmuneactivationandboostsresponsestoimmunecheckpointblockadeinpancreaticcancer”的研究成果。该文章使用非靶向代谢组学、转录组学（RNA-seq）及单细胞转录组学（scRNA-seq）、荧光流式对TMAO对PDAC肿瘤生长以及巨噬细胞的影响展开研究。
研究思路
研究结果
1、肠道微生物衍生的TMAO驱动PDAC中TME的免疫激活并减少肿瘤生长
首先作者采用抗生素甲硝唑改变小鼠肠道菌群，以观察肿瘤生长的变化。结果发现甲硝唑可以明显增加肿瘤大小（图1A）。通过对小鼠血清的非靶代谢组学分析发现，受影响最大的是TMAO，平均减少了约73倍（图1B）。通过腹腔注射外源TMAO或者TMA，发现肿瘤大小和重量明显减少。
通过荧光流式分析发现，TMAO或TMA处理后，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中主要组织相容性复合体I类（MHCI）、MHCII和CD86等刺激性标志物的表达增加；同时，抗炎标志物Arg1的表达明显减少，共同表明向免疫刺激性TAM表型转变（图1E和F）。效应性T细胞的激活大幅增加，表现为IFN-γTNF-αCD8和CD4T细胞的百分比增加，以及CD8和CD4v+T细胞上的激活标志物CD44增加（图1G）。
此外，血清中的TMAO水平与IFN-γTNF-αCD8T细胞的百分比呈正相关，与肿瘤重量呈负相关。此外，TMAO也激活了小鼠外周器官及淋巴组织的免疫。这些结果说明TMAO或TMA可能通过重新配置肿瘤环境，使其处于免疫激活状态而抑制肿瘤生长。诱导外周组织的免疫激活可能有助于TMAO的肿瘤抑制作用。
图1
TMAO或TMA驱动PDAC的TME中免疫激活
2、饮食中的胆碱或肠道菌TMA裂解酶可以复制TMAO导致的表型
随后作者通过向食物中增加胆碱来验证这一结果。通过非靶代谢组学分析发现，补充胆碱的小鼠中TMAO和TMA的水平增加，且与PDAC尺寸的明显减少有关（图2A和B）。而且，补充胆碱导致的免疫刺激作用与直接给予TMAO相似。具体来说，在TAMs上MHCI和MHCII等刺激标志物的表达明显增加（图2c）。也观察到其他先天性免疫细胞的激活标记增加，包括CD11bLy6CLy6G-单核骨髓源性抑制细胞（MDSCs）（M-MDSC）、CD11bLy6CLy6G多核MDSCs（PMN-MDSC）和抗原呈递的CD+树突状细胞（DCs）。这些分析还显示了活化的CD8和CD4T细胞的明显增加，如IFN-γTNF-αCD8和CD4T细胞百分比的增加与活化标志物CD69的增加有关（图2D和图S4D和E）。而TMAO的产生取决于肠道菌群酶CutC/D的活性。
为研究CutC/D酶活性是否是TMAO抗肿瘤作用所必需的，作者使用CutC/D酶抑制剂氟甲基胆碱（FMC）抑制CutC/D活性。结果发现，FMC处理后明显降低了循环TMAO水平，与甲硝唑相似（图2F）。与对照组相比，FMC治疗还与PDAC负担的明显增加有关（图2G）。此外，FMC明显增加了Arg1的表达，同时减少了TAMs上的MHCII，表明TAM免疫刺激表型的整体减少（图2H）。CDDCs的免疫刺激表型也减少了，表现为MHCI和IL-12p40表达的减少（图S4G）。最后，IFN-γTNF-αCD8和CD4T细胞的百分比明显下降，这表明效应性T细胞反应下降（图2I）。这些数据表明，TMAO诱导的TAMs和其他免疫细胞的免疫刺激表型至少部分是由于肠道细菌酶CutC/D的活性。
图2
饮食及肠道菌群干预复制了TMAO的抗肿瘤效果
3、TMAO驱动了PDAC免疫浸润中的抗肿瘤转录作用
接下来，作者为了解TMAO对TAMs的影响，采用转录组学RNA-seq对TAMs进行研究。结果发现，TMAO处理组的个基因转录物发生了明显的变化，与对照组相比向免疫刺激状态的转变相一致。上调的基因包括许多参与炎症的基因，如Nr4a3、H-Q5、H2-Q6、Irf3、Irf5、Acod1、Def6和Ccrl2（图3A）。下调的基因包括Trim29、Tgfb3、Cyp1b1、Pparg和Mmp12（图3A）。
为进一步了解TMAO对肿瘤浸润性免疫细胞的转录影响，作者采用scRNA-seq对CD45免疫细胞进行分析。结果发现，多个免疫细胞亚群被分隔成14种具有不同转录谱的细胞类型（图3C）。此外，发现免疫刺激标志物增加，包括I型IFN反应性转录调节器（如NF-κB、IRF7和STAT1）、炎症细胞因子（如IL-15、IL-12、IFN-β和IL-1β）和成本刺激分子（如CD40），而免疫抑制标志物（如AHR、VEGF和IL-10）则减少（图3E）。另一方面，TMAO也影响了T细胞的转录谱，被激活的功能包括CD8T淋巴细胞的增殖、细胞的免疫反应、抗原表达和肿瘤细胞系的细胞死亡，被抑制的功能包括调节性T淋巴细胞的数量、肿瘤细胞的增殖、纤维组织肿瘤和骨髓细胞的增殖（图3F）。
为进一步了解TMAO的抗肿瘤作用是否需要TAMs和/或CD8T细胞的参与。作者在PDAC小鼠中使用抗CSF1加氯膦酸钠耗尽巨噬细胞，发现耗尽TAMs后，与对照组相比，TMAO不再减少肿瘤负担，这表明TAMs可能参与了TMAO的抗肿瘤作用（图3G）。这些结果表明，TMAO通过重新配置TME中的免疫细胞，使其处于更活跃的状态，从而抑制了肿瘤的生长。
图3
TMAO驱动了PDAC中TME的免疫激活
4、TMAO介导巨噬细胞获得免疫刺激表型
随后，作者想确定TMAO是否对巨噬细胞的功能表型有直接影响。通过使用脂多糖或同时添加IFN-γ在有TMAO存在或者不存在的情况下，处理小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。结果发现，TMAO提高了促炎症细胞因子（IL-6和IL-12p40）的分泌，减少了抗炎症细胞因子IL-10的分泌。
通过RNA-seq，作者发现巨噬细胞暴露于TMAO后，超过个基因的表达发生了明显的变化。被激活的途径包括哺乳动物雷帕霉素（mTOR）信号、IFN信号，以及一氧化氮和ROS的产生，被抑制的途径包括PPAR信号、sirtuin信号和PTEN信号。
为了解TMAO在肿瘤环境下对巨噬细胞的影响，作者将BMDM暴露在没有或有TMAO的PDAC肿瘤调理介质（TCM），随后通过RNA-seq分析发现，TMAO促使与免疫抑制（包括）、基质金属蛋白酶（包括）和细胞外基质重塑（包括）有关的基因表达明显下降。相反，TMAO增加了免疫刺激基因的表达（包括）。体内TMAO也明显增加了TAMs中I型IFN途径的调节因子（如）（图3B和E）。总之，这些结果表明，TMAO诱导了一种免疫刺激性巨噬细胞表型，这种表型与I型IFN反应的增加有关；这种I型IFN反应的增加可能是TMAO抗肿瘤作用的一个关键机制。
图4
通过促进I型IFN反应激活的TMAO信号
5、TMAO增强了I型IFN反应并以I型IFN依赖的方式发挥抗肿瘤作用
为了验证TMAO对I型IFN的激活效用。作者采用I型IFN的已知激活剂如ISD、poly（dG:dC）等刺激BMDM。结果发现，ISD等激活剂导致I型IFN反应基因的表达增加（图4C）。TMAO诱导对ISD和poly（dG:dC）的表达（图4C），但只诱导对poly（dG:dC）的表达（图4C）。TMAO还增加了活化标志物的表面表达，包括CD86、MHCII和PDL1，以及用ISD刺激后MHCIIPDL1巨噬细胞的百分比（图4D）。这些结果表明，TMAO增强了I型IFN反应，并可能通过刺激I型IFN途径促进获得免疫刺激巨噬细胞表型。
6、TMAO直接改变了巨噬细胞表型以支持T细胞反应及降低PDAC负担
为验证TMAO刺激的巨噬细胞是否也能抑制PDAC的生长，作者采用TMAO刺激的巨噬细胞治疗患有肿瘤的小鼠。结果发现，与未经处理的对照组相比，接受对照组巨噬细胞的小鼠的肿瘤负担略有增加（图5C）。与接受对照组巨噬细胞的小鼠相比，接受TMAO刺激的巨噬细胞的肿瘤负担平均下降了2.4倍以上（图5C）。接受TMAO刺激的巨噬细胞的小鼠显示出强大的活化特征，与接受对照巨噬细胞的小鼠相比，CD8和CD4T细胞上的IFN-γ、Ki-67、CD和CD44明显上调（图5D和E）。这些结果共同表明，TMAO将巨噬细胞塑造为一种表型，增强了效应性T细胞反应，减少了PDAC生长。
图5
TMAO通过促进效应T细胞激活以塑造巨噬细胞反应并降低PDAC生长
7、人类巨噬细胞汇总也发现了TMAO的促炎作用
随后，作者在人类巨噬细胞上验证TMAO的促炎症作用。发现，在TCM刺激的巨噬细胞培养物中加入TMAO，可显著增加促炎症基因（包括IFNR1、IL-6、CCL-5、TNFA和IL-1B等）的表达，并显著降低抗炎症基因IL-10的表达（图5F）。这些结果表明，TMAO也推动了人类巨噬细胞的促炎症反应，并可能在人类中以类似于在小鼠中观察到的方式发挥作用。
8、TMAO使PDAC对免疫检查点治疗敏感并提高PDAC小鼠生存率
由于在PDAC小鼠中施用TMAO或TMA，或在饮食中补充胆碱，都会明显增加PD1Tim3CD8T细胞的肿瘤浸润（图6A和B），这表明，将TMAO与anti-PD1或anti-Tim3结合起来，可能比单独使用任何一种干预措施都更有效。因此，作者对此展开研究，发现单独的anti-PD1并没有减少肿瘤负担；然而，与单独的TMAO或对照组相比，anti-PD1加TMAO的组合确实明显减少了肿瘤重量（图6C）。与单一治疗或未治疗的对照组相比，联合治疗组的骨髓细胞（包括TAMs、MDSCs和CDDCs）的细胞表面标志物MHCI明显增加，这表明联合治疗增加了这些细胞群的免疫刺激表型（图6D）。这与显著的效应性T细胞反应有关，包括CD44Ki-67以及IFN-γTNF-αCD8和CD4T细胞百分比的明显增加，表明T细胞的大量增殖和激活状态（图6E）。此外，胆碱代谢物TMAO或TMA与ICB（anti-PD1加anti-Tim3）相结合时，可改善PDAC对ICB的反应性和肿瘤小鼠的生存率（图6G和H）。
图6
施用TMAO或TMA增强了PDAC对ICB的反应
9、产TMA菌群丰度及CutC基因表达与PDAC患者对治疗反应增强有关
最后，作者通过分析以往研究中PDAC长期生存者和短期生存者中的肠道菌群，发现，与短期生存者相比，长期生存者中Bacillus和Paenibacillus的相对丰度明显更高（图7A）。由于本文之前的研究表明，作者假设肿瘤对anti-PD1的临床反应可能与含有CutC的细菌的存在或粪便微生物组中CutC基因的表达相关。通过利用他人的研究数据发现，与PD1无反应者相比，反应者中含有CutC的Bacillus的相对丰度更高（图7B）。还发现，18个细菌菌株的anti-PD1反应和CutC表达之间的重要关联，包括（图7C）。这些菌株属于两个细菌科，即梭菌科（Clostridiaceae）和肠球菌科（Enterococcaceae），与无反应者相比，它们在反应者中含量丰富（图7D）。此外，反应者中CutC的表达明显增加（图7E），而且CutC的高表达与anti-PD1后总生存率的提高明显相关（图7F）。这些结果共同表明，含有CutC的细菌的存在和CutC基因的表达与癌症患者的生存率提高和对anti-PD1的反应有关。
图7
含CutC细菌的丰度以及提高CutC基因表达可以促进PDAC患者生存并提高对anti-PD1反应
相关讨论
肠道微生物衍生的代谢物TMAO和抗PDAC肿瘤免疫反应之间有一种未曾预见的联系。TMAO诱导了巨噬细胞的免疫刺激表型，增强了效应性T细胞的功能，并使PDAC对ICB有反应。在临床上，含有CutC的细菌与anti-PD1的反应改善有关。
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