本期解读
题目：
Proteomeprofileofglycrol-mediatedsalt-reductioncuredmeatrevealstheformationmechanismofeatingquality
期刊：FoodChemistry
影响因子：7.
发表单位：贵州大学酿酒与食品工程学院
作者：ChunliLiuetal.
发表时间：.2.9
研究手段：蛋白质组学
一、研究背景
风味独特的火腿、腊肉等腌肉制品广受大众青睐，但因其腌制时使用了较高的食盐添加量，从而导致成品钠盐含量高，高钠盐的摄入是高血压、癌症、心血管等慢性疾病的催化原因之一，故需寻找新的低钠盐腌制方法以降低火腿的钠盐含量。目前虽然已有低盐腌制的方法研究，但通过改变溶解食盐的介质以降低肉制品中食盐含量或者提升品质的研究却鲜有报道。
二、研究结果
1.腌肉样品的质量
表1列出了丙三醇腌制肉样品(EG-B5、EG-B10、EG-B15、EG-B20和EG-B25)和对照腌制肉样品(CG-A)的盐含量、含水量、持水性和质地。丙三醇能减缓腌肉中氯化钠的渗透，且随着丙三醇用量的增加而减缓(R2大于0.9)，添加丙三醇可以明显降低腌肉中的盐含量，这可能是由于丙三醇介导的腌制液粘度增加，降低了氯化钠在腌制肉中的扩散速率。与对照腌制肉样品(CG-A)相比，所有丙三醇腌制肉样品的水分含量均显著降低(P0.05)(除EG-B5外)。结果表明，氯化钠、丙三醇和水组成的三元体系可以去除腌制肉中的水分，但当丙三醇含量超过15%时，肉制品的水分含量不会继续下降。因此可以得出结论，丙三醇对腌肉中水分的去除具有双向调节作用，并且能够抑制氯化钠向腌肉中扩散。
此外，丙三醇的添加显著降低了腌制肉的蒸煮损失(P0.05)，这表明在腌制过程中丙三醇的存在有助于提高腌制肉制品的持水性，与CG-A组相比，EG-B组的剪切力显著降低(P0.05)，说明丙三醇可以改善腌制肉的嫩度。此外，EG-B组腌制肉的硬度、弹性、咀嚼性明显低于CG-A组，因为肉制品的质地与凝胶形成过程中的蛋白质相互作用相关，硬度降低的原因可能与添加丙三醇有关，它可以降低腌肉中的盐含量，肌原纤维蛋白的溶解度和参与相互作用的蛋白质数量随着腌制肉中盐浓度的增加而增加，导致其硬度也增加。丙三醇作为固化介质，可以降低肉制品的水分活度，从而延长其保质期，这是因为丙三醇可以对腌制肉中的水和盐含量发挥双向调节作用，从而提高肉的嫩度和保水性。
2.定量蛋白质组学分析和差异蛋白鉴定比较
为了评估蛋白质表达谱并全面了解丙三醇介导的固化过程中的蛋白质组学变化，进行了TMT标记的定量蛋白质组学分析。LC-MS/MS分析产生了个谱图，其中个单肽、个蛋白质和个可量化蛋白质来自CG-A和EG-B10组，错误发现率(FDR)≤0.01。大多数已鉴定的肽含有约7-20个氨基酸(图1A)，大多数蛋白质(72.47%)的分子量范围如下：10-20kDa()、20-30kDa()、30-40kDa()、40-50kDa()和50-60kDa()(图1B)。此外，鉴定出的蛋白质具有较高的肽覆盖率，其中36.7%的蛋白质具有超过20%的序列覆盖率(图1C)。此外，其中约55.43%含有三种或三种以上的肽。此外，这些蛋白质主要分布在细胞质、线粒体和细胞核中，以及细胞外空间中，这表明盐渍化不仅会导致细胞破裂，还会破坏线粒体和其他细胞器，导致蛋白质释放。
为了全面了解丙三醇介导的固化组(EG-B10)与对照组A(CG-A)中的蛋白质组学变化，该研究将分析重点放在差异蛋白(DAPs)上。DAPs的识别基于两个标准：“倍数变化＞1.3或＜0.77，以及P＜0.05”。研究共发现种蛋白质在CG-A和EG-B10组之间存在显著差异，包括种上调蛋白和种下调蛋白，DAPs的数量占总定量蛋白质的26.52%。此外，22种蛋白质(例如NECAB1、MCM10、DES、ACTRT2、RPS9、ACTN2和VIM)增加了2倍以上，EG-B10中DECR1和MKRN2的变化小于0.5倍(图1D)。根据图1E的DAPs亚细胞定位分析可知，DAPs主要分布在细胞核和线粒体中，根据分类可分为六大功能类别，包括信息处理与存储(19.66%)、信号转导(16.95%)、细胞结构(19.33%)、蛋白质翻译修饰(12.20%)、新陈代谢(20.68%)和其他(11.19%)。
图1所有已鉴定蛋白质的肽长度(A)、质量(B)、覆盖分布(C)。(A)X轴为肽长度，Y轴为肽数；(B)X轴为分子量(kDa)，Y轴是所有已鉴定蛋白质的数量；(D)X轴是倍数变化，Y轴是蛋白质数量(蛋白质数量条形图上方的数字)；(E)亚细胞结构的位置和分布图。饼图显示了差异丰富的蛋白质在其亚细胞结构中的百分比。
2.DAPs的GO功能注释和富集分析
利用编码DAPs的基因，通过GO分类鉴定CG-A和EG-B10蛋白的细胞成分、分子功能和生物过程。GO二次注释分析表明，所有DAPs都参与了86个细胞成分、49个分子功能和83个生物学过程的变化。在生物过程类别中，DAPs主要参与调节生物过程(8.28%)、细胞代谢过程(7.57%)、有机物代谢过程(7.47%)、初级代谢过程(7.26%)、细胞成分组织(6.81%)和氮化合物代谢过程(6.65%)(图2A)。在细胞成分类别中，大多数DAPs分布在细胞内空间(17.65%)、细胞内细胞器(15.71%)、膜结合细胞器(13.00%)、细胞器腔(7.92%)、非膜结合细胞器(7.71%)和内膜系统(5.28%)(图2B)。分子功能分析(图2C)表明CG-A和EG-B10样品中的DAP主要参与蛋白质结合(20.45%)、有机环状化合物结合(10.51%)、杂环化合物结合(10.37%),离子结合(7.95%)，水解酶活性(6.25%)、大分子复合物结合(5.11%)和其他功能，以上表明这些功能可能在丙三醇介导的固化中起关键作用。
图2根据GO二级注释对CG-A和EG-B10样品中的DAPs进行分类：(A)生物过程；(B)细胞成分；和(C)分子功能。
表2为DAPs的GO富集分析。对个上调蛋白的分子功能分析表明，共有8个代表性GOterm，其中GO:、GO:和GO:参与了NADH脱氢酶活性，而其他GOterm(GO:、GO:、GO:、GO:和GO:)与核糖体结构成分、细胞骨架结构成分、肌肉结构成分、主要组织相容性复合体(MHC)蛋白结合和MHCI类蛋白结合有关。细胞成分富集的4个GOterm(GO:、GO:、GO:和GO:)表明DAPs主要分布在核糖体中，其他GOterm(GO:、GO:、GO:、和GO:1990)表明DAPs也是线粒体的组成部分。与上述结果一致，生物过程类别中的10个GOterm表明DAPs与核糖体加工和能量代谢密切相关，例如核转录的mRNA分解代谢过程(GO:)和mRNA分解代谢过程(GO:)。此外，10种上调蛋白在肌丝滑动中富集(GO:)。
在个下调蛋白中发现30个富集的GOterm。对于分子功能类别，其中39个蛋白质富集杂环化合物结合(GO：)和有机环状化合物结合(GO：)，其中3个基因(F1SDN2、I3LP02和Q)在C-酰基转移酶活性的两个方面富集。所有其他下调蛋白都与DNA鸟苷和核苷酸结合有关(GO:、GO:、GO:、GO:)。对于细胞成分，3个下调蛋白(A0AA2Q7、A0ABLD2、F1SFA7)在三个方面富集：纤维状胶原三聚体(GO:)、胶原三聚体复合物(GO:)和带状胶原原纤维(GO:)。在生物过程类别中，2个下调蛋白(P、A0AA)主要与巨噬细胞的调控有关，而其他下调蛋白与细胞分化、细胞质转运、细胞分裂、肌动蛋白纤维聚合和RNA代谢有关。
3.DAPs的KEGG通路分析
对DAPs相关通路的分析可以提供CG-A和EG-B10组中导致腌制肉质量的分子机制间差异的信息。KEGG富集分析结果显示，氧化磷酸化通路(22个蛋白)、产热通路(24个蛋白)等代谢相关通路表达上调，提示EG-B10的代谢途径可能比CG-A更活跃。
在EG-B10中可以观察到以下情况：与疾病相关的通路，包括帕金森病(2种蛋白质)、亨廷顿病(22个蛋白质)、阿尔茨海默病(22个蛋白质)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(16个蛋白质)明显上调。此外，与信号传导相关的通路，包括逆行内源性大麻素信号传导(12种蛋白质)、紧密结合(10个蛋白质)和核糖体(20个蛋白质)也发生上调(图3A)。另一方面，涉及调节EG-B10肌动蛋白细胞骨架(10个蛋白质)的通路显著下调。同时，与代谢相关的通路，如乙醛酸和二羧酸代谢(4个蛋白质)、丙酮酸代谢(5个蛋白质)、果糖和甘露糖代谢(3个蛋白质)、戊糖磷酸途径(3个蛋白质)被下调。此外，与免疫系统和防御各种感染相关的通路，如沙门氏菌感染(4个蛋白质)、Fc-R介导的吞噬作用(5个蛋白质)、细菌侵入上皮细胞(4个蛋白质)、癌症中的蛋白聚糖(6个蛋白质)、百日咳(3个蛋白质)、麻疹(3个蛋白质)也被下调(图3B)。
图3EG-B10中上调蛋白(A)和下调蛋白(B)的KEGG通路富集分析。X轴为功能类型中差异蛋白与鉴定蛋白变化倍数之比的Log2换算值，Y轴是KEGG通路，彩色圆圈表示富集的P值，它们的大小表示通路中差异蛋白的数量。
根据KEGG分析，氧化磷酸化通路和产热通路均显著上调和富集。在氧化磷酸化通路的总59个DAPs中，发现22个在EG-B10中上调，这22个上调的DAPs分布在氧化磷酸化通路5个复合物的4个中(图4A)。在这22个DAPs中，12个参与NADH脱氢酶复合物(ComplexI)，这是氧化磷酸化的第一步。与对照组相比，EG-B中的两种蛋白UQCRFS1和UQCRC2在细胞色素bc1复合物中分别显著上调1.36和1.41倍，在细胞色素c氧化酶(氧化磷酸化的后续步骤)中分别显著上调1.77和1.41倍。在氧化磷酸化的最后一步，6个上调蛋白是参与ATP合成酶的蛋白，其中与对照组相比，EG-B10中ATP合成酶的β亚基显著上调1.68倍。上述数据表明，EG-B10和CG-A样品的主要区别在于氧化磷酸化通路的初始和最终步骤。
核糖体是细胞中最复杂的细胞器之一，由一个小的40S亚基和一个大的60S亚基组成。在KEGG通路分析中鉴定的23个与核糖体相关的DAPs(图4B)中，只有3个DAPs，包括RPL4(0.69倍)、RPS27A(0.76倍)和RPS25(0.72倍)在EG-B10中下调，而其他DAPs上调超过2倍，包括Rps9(2.38倍)、Rps6(2.12倍)、Rps3(2.04倍)和Rps2(2.02倍)。这些结果表明丙三醇介导的固化可以影响核糖体蛋白的组成，这可能是肉质发生变化的原因之一。
图4部分显著富集的KEGG通路(A：氧化磷酸化，B：核糖体)
文章进一步分析了EG-B10中前10个PSM的DAPs(表3)。分析表明，8种肌肉相关蛋白(MYH4、MYH1、ACTA1、MYH7、MYH13、ACTC1、ACTN3和ACTB)在EG-B10中上调。这些蛋白质是肌原纤维蛋白的重要组成部分，负责骨骼肌的结构完整性，并参与肌肉收缩。分析还表明，肌球蛋白的肌肉亚型在EG-B10和CG-A样品中存在显著差异，这可能与丙三醇介导的EG-B10里脊肉腌制过程中盐含量的降低直接相关。以往的研究报道MYH1是一种重要的结构蛋白，可以影响肌肉功能，被认为是牛肉嫩度的潜在生物标志物。在此研究中EG-B10的水分和盐分含量低于CG-A，其肉质也存在差异，表明丙三醇引起的DAPs可能在介导腌制过程中发挥作用，导致各种生物事件的变化。此外，在EG-B10中显著上调的其他肌肉质量相关的DAPs中，包括结蛋白(DES)、α-肌动蛋白2亚型(ACTN2)和热休克蛋白家族(HSPB1和HSP90AA1)，以及下调的DAPs中，包括肌钙蛋白I(TNNI2)和肌钙蛋白T(TNNT3)，结蛋白、肌钙蛋白和肌动蛋白是细胞骨架的重要组成部分，有报道称，这些蛋白质可以作为判断肉类品质的标志物，如嫩度和保水性。此外，一些研究表明，肌钙蛋白可能参与了干腌火腿典型风味的形成，在此研究中，与CG-A相比，EG-B10中肌钙蛋白的表达水平下调，表明丙三醇介导的腌制可能影响火腿风味的形成。
4.差异蛋白的相互作用网络
蛋白质通常不会单独发挥作用，而是与其他蛋白质相互作用以发挥各种功能。图5为CG-A和EG-B10的PPI图，网络的簇代表蛋白质-蛋白质关联，每个网络节点代表每个蛋白质，蛋白质-蛋白质相互作用富集的P值为1.0e-16，聚类系数为0.。从蛋白质相互作用网络图中可以看出，参与肌动蛋白细胞骨架、粘附连接和紧密连接的蛋白通过ACTB蛋白紧密连接，表明ACTB蛋白在这些信号通路中起着关键作用。参与氧化磷酸化(包括NDUFS2、NDUFS1、UQCRC2和COX5A)和丙酮酸代谢(包括AMDH2、PDHB、FH、DLD和PDHA1)的蛋白质之间存在强烈的相互作用。除此之外，还发现来自线粒体的一些蛋白质与细胞核等其他细胞器存在一些相互作用，这进一步证实了盐渍过程会导致线粒体和细胞核等其他细胞器的破裂。上述结果表明，丙三醇介导的固化改变了肌动蛋白细胞骨架、核糖体和氧化磷酸化的调节，这与KEGG通路富集分析一致。
图5差异蛋白互作网络图。网络簇代表蛋白质-蛋白质关联，每个网络节点代表每个蛋白质，蛋白质-蛋白质相互作用的P值为1.0e-16，聚类系数为0.。
三、结论
在这项研究中，提出了一种新的固化方法，即低盐丙三醇介导的固化。比较了EG-B10和CG-A样品的蛋白质组学特征，研究内在蛋白质在固化过程中的作用机制。基于TMT的定量蛋白质组学分析共鉴定出个DAPs，分布在细胞质、细胞核和线粒体中。DAPs的生物信息学分析进一步表明EG-B10中产热、氧化磷酸化和一些疾病相关通路显著上调，而肌动蛋白细胞骨架的调节通路显著下调。ACTN2、DES和热休克蛋白(HSPB1和HSP90AA1)可能是引起肉质变化的主要蛋白。这项研究提供了腌制肉制品分子水平的更多信息，证明丙三醇介导的腌制可以提高腌制肉制品的质量，是生产低钠腌制肉制品的有效方法。
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