骨髓瘤细胞能在体外无限制分裂增殖,B淋巴细胞(抗体形成细胞)经抗原免疫后能合成分泌抗体。骨髓瘤细胞和B淋巴细胞经融合剂融合后形成杂交瘤细胞,杂交瘤细胞既能在体外无限繁殖,又能合成分泌抗体。通过检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞,由其产生的只识别抗原分子上某一抗原决定簇的抗体,即为单克隆抗体。
1.RPMI、小牛血清。
2.HAT选择培养液:次黄嘌呤(hypoxanthine,H);氨蝶呤钠(aminopterinsodium,A);胸腺嘧啶(thymidine,T)。
3.细胞冻存液:50%小牛血清;40%不完全培养液;10%DMSO(二甲亚砜)。
4.细胞性抗原、福氏完全佐剂、75%酒精、PEG。
5.弯头滴管、BALB/c小鼠、无菌注射器、无菌剪刀、96孔培养板、不锈钢筛网、一次性塑料培养板及培养瓶。
6.倒置显微镜、低温离心机、低温冰箱、液氮罐等。
一、细胞融合前准备
(一)免疫BALB/c小鼠
1.细胞性抗原
(1)初次免疫:1×/0.5ml小鼠腹腔内注射。
(2)第二次免疫:初次免疫2~3周后,1×/0.5ml小鼠腹腔内注射(ip)。
(3)加强免疫:3周后,1×/0.5ml小鼠腹腔内注射或静脉内注射。3天后,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
2.可溶性抗原
(1)初次免疫:1~50μg抗原加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般4~5点/只,0.2ml/点)。
(2)第二次免疫:初次免疫3周后,剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或腹腔内注射,剂量不宜超过0.5ml。
(3)第三次免疫:3周后,剂量同上,不加佐剂,腹腔内注射。
(4)5~7天后采血测其效价,检测免疫效果。
(5)加强免疫:2~3周后,50~μg抗原,腹腔内注射或静脉注射。3天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
(二)饲养细胞
在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备:1.6~10周龄BALB/c小鼠颈椎脱臼处死,浸泡于75%酒精,消毒3~5min。用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜,用无菌注射器注入6~8ml培养液反复冲洗,吸出冲洗液放入10ml离心管,r/min离心5~6min。用20%小牛血清或胎牛血清的培养液混悬,调整细胞数1×/ml。2.加入96孔板,μl/孔,放入37℃、CO2孵箱培养24h后使用。
(三)骨髓瘤细胞
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/O、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.等。用于骨髓瘤细胞的培养液有RPMI、DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%~20%,细胞的最大密度不得超过/ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3~5天传代一次。细胞的倍增时间为16~20h,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,取处于对数生长期的骨髓瘤细胞,活细胞计数高于95%,这也是决定细胞融合成败的关键。(四)免疫脾细胞通常取最后一次加强免疫3天以后的脾脏,制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较高,融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次,置平皿中不锈钢筛网上,研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍,脾细胞数为2×左右。
二、细胞融合选择杂交瘤细胞
(一)细胞融合流程
1.取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/O,0r/min离心5min,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2次。
2.同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2次。
3.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,r/min离心8min。
4.弃上清,用滴管吸净残留液体,以免影响PEG的浓度。
5.轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。
6.在室温下融合
(1)30s内加入预热的1ml45%聚乙二醇(PEG,Merek,相对分子质量为,含5%DMSO),边加边搅拌。
(2)作用90s,若冬天室温较低时可延长至s。
(3)加预热的不完全培养液,终止PEG作用,每隔2min分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。
7.r/min离心6min。
8.弃上清,先用6ml左右20%小牛血清RPMI轻轻混悬,切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。10ml
9.根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,每块96孔培养板10ml。
10.将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板,μl/孔,37℃、5%CO2孵箱培养。
(二)HAT选择杂交瘤细胞骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT),对氨蝶呤钠敏感,在HAT选择培养液中不能生长。免疫脾细胞虽然有HGPRT,但不能在体外无限繁殖。只有杂交瘤细胞,才能在HAT选择培养液中无限繁殖(图12-1)。
HAT培养液选择杂交瘤细胞HGPRT:次黄嘌一般在融合24h后加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂,50×HAT贮存,用时取1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,μl/孔,所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。一般认为,融合后最初补加的量可用全量的2/3进选择,可得到满意的筛选结果。50×HAT的成分为:H:5×10-3mol/LA:2×10-5mol/LT:8×10-4mol/L一般选择HAT选择培养液维持培养两周后,改用HT培养液,再维持培养两周,改用一般培养液。
三、抗体的检测筛选
杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为首选。
常用的方法有:
1.ELISA,用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。
2.RIA,用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3.FACS(荧光激活细胞分类仪),用于细胞表面抗原McAb的检测。4.IFA,用于细胞和病毒抗原McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法,故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立,避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存
克隆化一般是指将目的抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆,可能会有数个甚至更多的克隆。要想将这些多个克隆细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于目的抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则目的抗体分泌细胞会被抗体非分泌细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比目的抗体分泌细胞的生长速度快,两者竞争的结果会使目的抗体分泌细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期地再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
(一)杂交瘤细胞克隆化方案
克隆化的方法很多,最常用的就是有限稀释法和软琼脂平板法。
1.有限稀释法
(1)制备饲养细胞悬液(同融合前准备)。
(2)阳性孔细胞的计数,并调整细胞数在(1~5)×/ml。
(3)取个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,μl/孔,加A、B、C三排,为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,μl/孔,加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。
(4)培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液μl/孔。
(5)第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
2.软琼脂平板法
(1)软琼脂的配制含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI;1%琼脂水溶液,高压灭菌,42℃预热;0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI配制而成,置42℃保温。
(2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
(3)按个/ml、个/ml或0个/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
(4)1ml0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
(5)混匀后立即倾注于琼脂基底层上,置室温中10min,使其凝固,置于37℃、5%CO2孵箱中。
(6)4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
(6)检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。
(二)杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞。每次克隆化得到的亚克隆细胞都十分保贵,因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞在培养过程中随时可能发生污染、抗体分泌能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则会因为上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法与其他细胞系的冻存方法一样,原则上每支安瓿应含细胞数1×以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。冻存液最好预冷,操作动作应轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃时可放入液氮中;或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性。在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:
1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10~60μg/ml,如果用于大量生产,费用较高。
2.体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。
(1)实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按(1~3)×/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2ml,共2~4点。待肿瘤长到一定大小后(一般10~20天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体,含量可达到1~10mg/ml。但采血量有限。
(2)腹水的制备
常规方法是,BALB/c鼠先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊,1~2周后腹腔注射1×个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡之前,处死小鼠。用滴管收集腹水于试管中,一般一只小鼠可获得1~10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5~20mg/ml,这是目前较常用的方法。还可将腹水中的细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔,则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其作如下方面的鉴定:1.单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法,如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等。如制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外,还应用其他脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应,以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。又如制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应,其次是与其他细胞因子间有无交叉。2.McAb的Ig类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类,则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在做双扩试验时,如加入适量的PEG(3%),将有利于沉淀线的形成。3.单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液中的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应,腹水效价可达5.0×。而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0×。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。4.McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验和测相加指数的方法,测定McAb所识别的抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。5.McAb亲和力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
六、影响因素、失败原因分析
由于制备McAb的实验周期长、环节多,所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有:
1.污染 包括细菌、真菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最棘手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之,以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清。此外,其他添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室,要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔,待长出腹水或实体瘤时,无菌取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。
2.融合后杂交瘤不生长 在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素:①PEG有毒性或作用时间过长;②小牛血清的质量太差,用前没有进行严格的筛选;③骨髓瘤细胞污染了支原体;④HAT有问题,主要是A含量过高或HT含量不足。
3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体(1)融合后有细胞生长,但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变,变成A抵抗细胞所致。(2)有可能是免疫原抗原性弱,免疫效果不好。(3)对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性,可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能是发生染色体丢失。Goding()曾提出“三要”、“三不要”,是防止抗体停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管;要经常应用倒置显微镜检查细胞的生长状况;要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长”,以防非分泌的杂交瘤细胞将成为优势,压倒分泌抗体的杂交瘤细胞;不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月;不要使未经克隆化的杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传代。
4.杂交瘤细胞难以克隆化 可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关,或由于细胞有支原体污染,使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化,则应在培养液中加HT。