MLL基因易位引起的急性白血病可分为淋巴性白血病、髓细胞白血病或两种表型均有，约占5%-10%的成年患者和70%的婴幼儿患者发现存在MLL基因的异位。而带有MLL基因重排的白血病患者往往具有预后差、易复发和生存期短的特点，尤其是婴幼儿急性淋巴白血病，因此研究更有效、毒性更小的白血病治疗药物是目前药物化学家的主要研究方向之一。
当发生染色体易位时，MLL基因会与一种伴侣基因发生融合产生新的嵌合基因，该基因能够编码一种致癌MLL融合蛋白，而MLL融合蛋白与辅助因子Menin蛋白的相互作用致使MEIS1和HOXA基因的过表达，最终促使MLLr白血病的发生与发展。因而，利用小分子阻断Menin-MLL的蛋白-蛋白相互作用被认为是治疗MLLr白血病的潜在治疗策略。目前为止，化学家已经陆续报道了多种不同类型的Menin-MLL相互作用抑制剂（图1），但均存在一些口服生物利用度低或代谢稳定性差的问题，因此，发展生物利用度高和代谢稳定性优异的Menin-MLL相互作用抑制剂是目前新的研究方向。
近日，密歇根大学安娜堡分校的王少萌教授基于课题组报道的Menin-MLL抑制剂M-，对其进行结构修饰发现了口服生物利用度优异的共价抑制剂M-。相关成果发表在J.Med.Chem.上（DOI:10./acs.jmedchem.1c）。
图1代表性menin抑制剂。图片来源：J.Med.Chem.
基于化合物M-和M-的结构，作者认为共价Menin抑制剂应包含非共价的Menin结合骨架和与半胱氨酸残基结合的亲电基团，并且希望通过修饰非共价结合骨架实现口服生物利用度的提高。基于化合物M-，作者初步设计出缺少亲电基团的非共价Menin抑制剂7，并结合M-的结构特点进行结构优化（图2）。引入甲氨基和二甲基化的甲氨基分别得到化合物8和9，两者的Menin结合活性均有所增强，尤其是化合物9，更是达到了1.7nM。作者将R1位的二甲基氨基替换成氮杂环丁烷、四氢吡咯环、吗啉环和4-羟基哌啶环分别得到化合物10-13，相比于化合物8，Menin蛋白结合活性均略有增加，但除了化合物10外，化合物11-13的MV4;11和MOLM-13细胞抑制活性均显著下降，仅与化合物7相当。其中化合物10的结合活性和细胞抑制活性最为优异，可以作为进一步结构优化的基础。
图2R1基团构效关系。图片来源：J.Med.Chem.
基于对化合物10的PK性质研究，作者认为R2基团的变化可能影响哌啶环N原子的pKa，从而影响化合物的活性和PK，因此作者对linker区域R2位置进行了修饰（图3）。首先，引入F原子和甲基分别得到化合物14和15，其结合活性均没有明显变化，但细胞抑制活性均显著下降。接着，作者尝试添加给电子基团羟基和甲氧基得到化合物16和17，相比于化合物10，化合物17的结合活性略有增强（2.5nM），但细胞抑制活性并没有增强，甚至略有下降。最后，引入吸电子基团甲酯基团得到化合物18，其结合活性下降了10倍，几乎丧失了细胞抑制活性。
图3R2基团构效关系。图片来源：J.Med.Chem.
基于化合物17的PK性质，作者对R3位置进行了修饰（图4）。首先，作者将R3位的环丙基替换成M-中的Michael受体片段得到化合物19，相比于化合物17，其蛋白结合活性无变化，但细胞抑制活性均显著增加，说明化合物19在细胞内与Menin蛋白形成了共价结合。作者认为化合物M-和M-中正电基团可以增强化合物的蛋白结合活性和抗增殖活性，但同时也导致口服生物利用度降低。因此，作者尝试移除Michael受体上的正电基团得到化合物20，但其细胞抑制活性显著降低，作者猜想可能是化合物20的Michael受体并未处于能与Menin蛋白形成有效共价结合的最优位置。基于此，作者利用构象限制原理设计了化合物21-23，但其细胞抑制活性均显著降低。作者猜想利用对linker的构象限制使丙烯酰胺与Cys残基的巯基的共价结合处于最佳位置，从而增强其细胞抑制活性，最终设计出化合物24-26，发现除了化合物24，化合物25和26的细胞抑制活性均显著下降，说明共价结合对化合物的细胞抑制活性非常重要。
图4R3基团构效关系。图片来源：J.Med.Chem.
接下来，为了进一步考察化合物的细胞活性，作者利用质谱分析研究了化合物与重组人Menin蛋白的结合能力（图5）。结果显示，化合物19-26的Menin蛋白结合能力与其细胞抑制活性呈正相关，其中活性最好的化合物19具有最快的结合速度，活性仅次于化合物19的M-，其结合速度同样稍逊于化合物19，但其能够在长时间后达到%结合。
图5Menin抑制剂与重组人Menin蛋白结合。图片来源：J.Med.Chem.
为了进一步理解化合物与蛋白的结合模式，作者对化合物24与Menin蛋白的共结晶结构进行了分析（图6）。作者发现双环[2.2.1]环的刚性结构使得丙烯酰胺Michael受体片段与Cys残基的巯基形成共价键。此外，双环[2.2.1]环还与Val残基、Ala残基和Gly残基存在疏水相互作用。氮杂环丁烷基团的N原子与Asp残基带负电荷的羧酸残基形成电荷-电荷相互作用；甲氧基则与Tyr残基的苯酚基团的OH形成关键的氢键相互作用。
图6化合物M-与Menin蛋白的共结晶结构。图片来源：J.Med.Chem.
作者进一步评估了化合物M-对多种MLL细胞系的抑制活性和选择性（图7）。从表中可以看出，化合物M-表现出优异的的选择性，不仅对测试细胞系有高抑制活性，还对其余4种MLLr细胞系具有良好抑制作用，而对MLL野生型细胞系没有明显的抑制作用。表明化合物M-具有成为MLLr抑制剂的潜力。
图7化合物M-对多种MLL细胞系的抑制活性。图片来源：J.Med.Chem.
紧接着，作者利用qRT-PCR评估了化合物M-对MV4;11细胞的HOXA9和MEIS1基因表达的影响（图9）。结果表明，化合物M-以剂量依赖性方式抑制HOXA9和MEIS1基因的表达，且有效浓度仅为10nM和30nM。
图8化合物M-对基因表达的影响。图片来源：J.Med.Chem.
基于化合物M-的蛋白活性和细胞活性，作者对其进行了初步的小鼠PK性质研究（图9）。从表中能看出，化合物M-表现出优异的静脉注射PK性质，具有低清除率和良好的分布容积，而对于口服给药，其半衰期（T1/2）为2h，峰浓度（Cmax）为ng/ml，血浆药物暴露量（AUC0∞）为h*ng/ml，口服生物利用度（F）为49.4%。
图9化合物M-的小鼠PK。图片来源：J.Med.Chem.
最后，作者考察了化合物M-的体内抗肿瘤活性（图10）。在MV4;11皮下移植肿瘤模型中，化合物M-能够有效抑制肿瘤生长，肿瘤体积缩小比例可达32%，且并未出现明显的体重下降和毒性。由于M-具有优异的血浆蛋白结合率且在mg/Kg剂量下不会产生毒性，作者提高给药剂量观察是否能够达到更强的肿瘤抑制效果。结果显示，在mg/Kg剂量下，肿瘤生长明显被抑制，且也未产生明显毒性。
图10化合物M-的抗肿瘤生长活性。图片来源：J.Med.Chem.
由于MLLr白血病是一种骨髓疾病，作者研究了化合物M-在移植了荧光素酶标记的MV4;11细胞和骨髓CD45+白血病细胞的NCG小鼠转移模型中的肿瘤抑制活性（图11）。结果显示，化合物M-能够有效抑制MEIS1基因表达伴随着诱导CD45+细胞中细胞分化标志物ITGAM基因和CD11b的表达。有趣的是，M-能够抑制肿瘤生长同时降低CD45+CD33+白血病细胞的含量，且显著降低全身生物荧光信号强度，也未产生明显毒性。
图11化合物M-的抗肿瘤生长活性。图片来源：J.Med.Chem.
该类化合物的合成路线如图所示（图12）。首先，化合物27在TFA和二烷酸二甲酯处理下得到化合物28，28经DIBAL-H和NaBH4两步还原得到化合物29；9a在Boc酸酐条件下保护氨基，再经过苄基脱除和取代反应得到化合物8。关键的苯磺酰基片段36可由化合物32经取代、氧化及还原反应制备得到，其余化合物也可通过类似方法合成得到。
图12化合物9-13的合成。图片来源：J.Med.Chem.
小结：王少萌教授团队基于先前报道的化合物发现了高选择性、高口服生物利用度的Menin-MLL蛋白蛋白相互作用共价抑制剂，展现出一定的临床潜力，未来或许有望进入市场，为新的治疗策略提供一定思路。
参考文献：
Marschalek,R.MechanismsofleukemogenesisbyMLLfusionproteins.Br.J.Haematol.,,-.Caslini,C.;Yang,Z.;El-Osta,M.;etal.InteractionofMLLaminoterminalsequenceswithmeninisrequiredfortransformation.CancerRes.,67,-.Cierpicki,T.;Grembecka,J.Challengesandopportunitiesintargetingthemenin-MLLinteraction.FutureMed.Chem.,6,-.