宏基因组和GeoChip有着相似的地方，二者都可以用来研究群体基因功能。不一样的地方在于：宏基因组测序易受宿主基因组干扰，对于宿主污染较大的样品（如粪便、植物内生菌样品等）研究十分困难，而GeoChip作为寡核苷酸探针矩阵，可以特异性靶向功能基因，很好地克服了上述局限。事实胜于雄辩，今天给大家分享一篇应用GeoChip技术研究高寒地区植物叶际微生物及其功能多样性文献！不用再为寻找去除宿主基因组方法而头疼，GeoChip帮你轻松搞定！
安第斯高山生态系统中安第斯菊属物种叶际微生物及其功能多样性
MicrobialandFunctionalDiversitywithinthePhyllosphereofEspeletiaSpeciesinanAndeanHigh-MountainEcosystem
作者：CarlosA.Ruiz-Pérez,etal.
时间：.3
期刊：AppliedandEnvironmentalMicrobiology
IF：3.
一、研究背景
新热带安第斯山脉（NeotropicalAndes）中的高寒生态系统由孤立的高海拔地区组成，是世界多样性进化最快的地区。该生态系统暴露在严酷的环境条件中，如紫外辐射高发以及气温日变化对原生植物及其相关微生物群落施加的选择压力。高寒带特有植物，其叶际作为一种独特的微生物群落生态系统，具有独特的生存力和多样性，能够在相对其他生命形式很极端的条件下生存。
哥伦比亚高寒带最具象征性的植物“frailejón”，是该地区特有的安第斯菊属（Espeletia）植物。这些植物具有独特的适应性，可以抵御紫外线照射和日温度变化。它们与超过种动物密切相关，对于土壤健康、生态系统保持及调节水分的可利用性和储存碳的能力十分重要。Espeletia植物的微生物群落和功能多样性的分子生态学研究，为了解微生物如何与极端栖息地相互作用并适应极端生境提供了重要见解。
二、实验技术
16SrRNA基因V5V6区扩增子测序+GeoChip5.0芯片检测
样品采集:样本采集自LosNevados国家自然公园，ElCoquito温泉，三株相距10m以内的Espeletiahartwegiana（如图）。
叶（50-g）分三个层次，共两组用于内生菌和附生微生物研究：
上层：嫩叶；
中层：充分发育的成熟叶片；
下层：老叶或坏死部分。
根（1-5g）：采自其中两株。
DNA提取：PowerSoilDNAisolationkit(MobioLaboratories,Carlsbad,CA,USA)
图1采样点及Espeletisp.形态学概述三、主要结果
1、微生物群落组成和结构
通过高通量测序技术共获得条高质量序列，聚类得到个OTU。将Shannon和Simpson指数转化为物种的有效数目进行样品间比较发现，坏死部分和根部微生物多样性显著高于甚至是叶附生与内生部分的和（图2）。
图2群落多样性指数（A）Shannon，（B）Simpson
从图3可以发现数据中有少量古菌（0.1-16%），在所有样本中丰度最高的细菌门是酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、泉古菌门（Crenarchaeota）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）。
图3Espeletisp.微生物门水平的相对丰度
基于加权UniFrac距离的PCoA分析发现，根与叶际（叶附生和内生）、坏死部分样品分离。所有叶样品聚在一起，表明其群落之间相似且与根和坏死部分群落不同；叶附生和内生群落的相似性显而易见，两者之间仅有酸杆菌门、拟杆菌门和变形菌门的少量OTUs丰度不同（图3）。
图4基于加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）
2、代谢特征随植物微环境而变化
PICRUSt预测的功能分类显示基因涉及异生物质降解，碳水化合物、脂质、氨基酸及辅因子代谢、次级代谢物合成及能量代谢。涉及参与复制和修复途径的基因也有预测到，这和紫外辐射造成DNA损伤有关。虽然基于预测结果的PCoA中群落之间没有显著分离，但ANOSIM分析发现内生和根及坏死部分群落之间有显著差异（globalR=0.，p0.05，n=17，permutation=）。
GeoChip结果显示所有样品都有涉及碳固定/降解通路，氮、磷和硫代谢，有机污染修复，次级代谢，毒力相关及环境压力响应的基因。也发现了紫外暴露下叶微环境会有色素产生及DNA损伤修复基因。ANOSIM分析发现群落之间有显著差异（globalR=0.，p0.05，n=16，permutation=）；成对比较显示，附生、根和坏死部分群落有更大的相似性，内生与其它群落之间有显著差异；与功能预测相比，GeoChip结果的PCoA中内生样品与其它样品显著分离。
图5微生物代谢潜能分析（A）基于PICRUSt功能预测结果，（B）GeoChip分析结果
3、养分利用与生存
所有群落的碳循环通路基因富集，包括6个自养碳固定相关通路；同时也有发现异养代谢、碳降解相关通路在所有样品中富集，但在附生、坏死部分和根中更多（p0.05）。氮循环通路如硝酸盐同化还原、反硝化、硝化、固氮、氨化和厌氧氨氧化通路也在所有部分群落中出现，虽然富集水平低于碳循环通路。
图6几种碳降解基因标准化信号强度的均值
GeoChip检测还发现了微生物对不利环境条件的响应包括酸碱刺激、冷热刺激、葡萄糖/磷酸盐和氮限制、渗透胁迫、氧化胁迫、氧限制、严紧反应的基因，细菌色素产生和活性氧清除相关酶基因也有发现。
图7抵抗紫外相关基因标准化信号强度的均值
四、结论与亮点
本文基于对Espeletisp.相关微生物群落的系统发育和功能谱研究，分析了一种新宿主相关微生物群落，揭示了其功能生态学特征。本次调查为未来研究提供了一个起点，旨在了解安第斯菊属植物叶际微生物群落的适应性、功能作用以及它们在生态系统中的相关性，对植物保护带来更多启发。
此外，本研究数据还可用于比较地域限制性植物与更多全球分布物种之间的微生物群落的差异。
GeoChip芯片技术已经广泛应用于包括土壤、水体、海底沉积物、热泉、污水、生物反应器和动物肠道等多种生境的研究当中，对于解决微生物检测、植物生长、人体健康、生物多样性、污水处理、生物修复等众多领域中微生物的相关问题具有重大意义。
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