宏基因组探究生物结皮演替过程中氮循环模式

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氮循环是最重要的生物地球化学循环之一,而微生物是驱动自然环境中氮循环最重要的动力。应用宏基因组技术来研究自然环境中直接参与氮循环的功能微生物类群的总量和多样性是近年来环境微生物的研究热点之一。生物结皮(biocrust)是由土壤微生物、藻类、地衣和苔藓植物等孢子植物类群与土壤形成的有机复合体,具有较强的抗风蚀、水蚀功能。生物结皮是沙漠植被演替的先锋种,对促进沙漠植被演化具有重要作用,被誉为“荒漠土壤的盔甲”。目前,生物结皮中氮循环的演替生态学以及与生态系统过程的联系仍不清楚。

中科院水生生物研究所胡春香研究员团队以蓝藻被地衣或苔藓替代的代表演替阶段的四种天然生物结皮为研究样本,并分析了蓝藻逐渐成为优势微生物的三种模拟生物结皮作为对照,以探索N循环的演替变化及其与生态系统功能的联系机制。

研究设计

1、样本采集

(1)天然样本(naturalbiocrusts)

年、年、年和年在内蒙古腾格里东南缘附近的沙坡头地区采集了4种天然生物结皮:藻类结皮,A;蓝藻结皮,C;绿地衣结皮,G;苔藓结皮,M。

(2)模拟样本(Simulatedcrusts)

模拟生物结皮于年9月和年10月在内蒙古霍布克沙漠东缘进行了原位培养,接种从沙坡头生物结皮中分离出的菌种,接种后第11、35和52天采集代表分别为早期(Ae)、中期(Am)和后期(AI)发展阶段。

2、研究方法

16SrRNA基因扩增子测序,N循环功能基因nifH、nirK扩增子测序,宏基因组测序等

主要结果

1、微生物群落结构

NMDS分析(图1A)表明,细菌群落结构在天然生物结皮的不同演替阶段和模拟生物结皮的不同发育阶段之间存在显着差异(ANOSIM,R=0.,P=0.)。多样性指数(Sobs或Shannon)随着天然生物结皮的演替而增加,但在模拟生物结皮的整个发展过程中下降(图1B)。16SrRNA扩增子(图1C)和宏基因组测序(图1D)中,物种占比最丰富是蓝细菌门、放线菌门和α-变形菌门。随着天然生物结皮的演替,蓝细菌门的相对丰度降低,而酸杆菌门和γ-变形菌门的相对丰度增加,但通过模拟生物结皮的发展,这一趋势发生了逆转。

图1生物结皮的微生物群落结构

2、N循环通路相关基因丰度变化

基于宏基因组测序结果,NMDS和ANOSIM分析表明,天然生物结皮的不同演替阶段,以及模拟生物结皮的早期(Ae)和中晚期(Am,Al)的N循环有显著差异(R=0.,P=0.)(图2A)。对于天然生物结皮中的氮转化过程(图2B),铵同化(gdh、glnA、glt)基因的相对丰度最高。随着天然生物结皮的演替,nrfAH和nosZ的丰度增加,而其他基因如glt、ureABC、gls、amoABC、hao、narB、nirA、nirBD则呈下降趋势。模拟生物结皮中的N循环模式与天然生物结皮相似。

图2基于宏基因组测序分析的氮循环

GeoChip绝对定量分析结果表(图3),amoA、nirA和ureC平均丰度随天然生物结皮的演替逐渐降低,而nrfA和nosZ则呈现相反的趋势。随着模拟生物结皮的发展,nirA、narB和ureC基因丰度增加,nrfA和pnor丰度下降。

图3年天然生物结皮(A)和模拟生物结皮(B)氮循环关键基因GeoChip分析平均信号强度

定量PCR结果表明(图4),nifH和nrfA的基因拷贝在青苔结皮中最高。潜在的固氮率和氨氧化率在青苔结皮中最高,潜在的反硝化率在苔藓结皮中最高。

图4年天然生物结皮的nifH(A)和nrfA(B)基因拷贝,以及包括N2固定(C)、氨氧化(AO,D)和反硝化(E)在内的经典氮循环的潜在速率。

3、微生物对N循环的潜在贡献

在天然生物结皮中(图5A),与固氮相关的标记基因(nifH)在早期(A)和过渡阶段(C,G)主要属于蓝细菌门,而Alpha变形菌门在后期(M)中占主导地位。参与铵同化(gdh,glnA)和矿化(ureC)的主要微生物是Alpha变形菌门和放线菌门。氨氧化(amoA)主要由古细菌驱动的。在模拟的生物结皮中(图5B),与N循环相关的标记基因为与天然生物结皮具有相似的微生生物,但存在一些差异:

(1)潜在的固氮剂主要是Alpha和Beta变形菌门;

(2)与古细菌一样,Beta变形菌对氨氧化也很重要;

(3)有nxrA或narG基因的硝化螺旋菌门较多;

(4)Alpha变形菌门是参与反硝化每个步骤的最重要的细菌;

(5)厌氧氨氧化主要存在于浮霉菌门中。

图5年天然生物结皮(A)和模拟生物结皮(B)氮循环各关键基因相关微生物类群的相对丰度。

4、微生物群落与N-Cycle共发生网络

基于高丰度属和N循环marker基因的相关性(p0.),绘制了天然生物结皮的四个演替阶段的网络(图6)。在整个生物结皮演替过程中,早期(A)和过渡阶段(C,G),正负边数、平均度、网络异质性较低;而他们在后期(M)更高。对于藻类结皮(图6A),与反硝化相关的基因(nirK、norB、nosZ)和来自几个门的属形成了一个功能独立的模块。对于蓝藻结皮(图6C),功能模块较多,例如以蓝细菌和Alpha变形菌门为主与nifH、nrfA等基因相关的模块。对于绿地衣结皮(图6G),功能模块更多,例如主要来自Alpha变形菌门的属,与nrfA和nosZ聚集在一起。对于苔藓结皮(图6M),nrfA和来自几个门的属形成了最大的独立模块。随着天然生物结皮的演替,网络复杂性和相互作用增加,反硝化、DNiRA、glnA、nifH等相关功能发生明显变化。

图6N循环关键基因和天然生物结皮不同演替阶段的高丰度物种的共发生网络。

节点的颜色代表不同的模块,与右侧直方图横坐标标签的颜色一致。

5、N循环路径相关性和环境变量的影响

通过相关网络揭示了N循环路径的相关性(图7A),研究发现硝酸盐氨化(DNRA)与亚硝酸盐氧化之间存在很强的正相关关系(R=0.,P0.)。作为网络的枢纽,DNRN和亚硝酸盐氧化程度最高,与大多数途径呈显著正相关。环境因素对于每个N循环途径的影响,相关网络表明(图7B),NH4+与固氮、ANiRA和矿化显着正相关,相比之下,其余变量与固氮呈正相关。RDA分析探索了哪些环境因素影响天然生物结皮中的整个N循环功能,结果表明DON和NO3-是解释天然生物结皮中N循环变化的重要变量(p0.05)(图7CD)。

图7使用Cytoscape描述了N转化途径。

(A)以及环境因素和N转化途径(B)之间的spearman相关性。RDA分析天然生物结皮在途径水平(C)或基因水平(D)上环境因影响素。

总结

本研究通过宏基因组测序,探究了生物结皮N循环的整体模式和演替变化、微生物的贡献、环境变量的驱动机制、N转化途径之间以及N循环与生态系统之间的相关性。研究同时表明,生物结皮是利用宏基因组方法研究微生物生态系统功能和演替的理想自然模型。

参考文献

MetagenomicInsightIntoPatternsandMechanismofNitrogenCycleDuringBiocrustSuccession.FrontMicrobiol,.

Doi:10./fmicb..

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