引言年的诺奖颁发给了戴维·朱利叶斯和阿登·帕塔普蒂安，以表彰他们在“发现温度和触觉感受器”方面作出的贡献，主要是新的离子通道蛋白TRPV1和Piezo。之前的文章，小优跟大家一起回顾了两位大佬的发现之旅。其实，这是离子通道领域第三个诺奖。年，埃尔温·内尔以及伯特·萨克曼由于发明膜片箝电位记录技术，证实离子通道获奖。年，颁发给了发现水通道的彼得·阿格雷和利用X射线晶体成像技术展现离子通结构的罗德里克·麦金农。
图1离子通道蛋白
离子通道蛋白的研究方法针对离子通道的研究逐渐涉及许多科学技术，例如电生理学，免疫学，基因工程和影像学等。随着研究体系的发展，目前形成通过基因工程选择特定基因，构建文库，过表达或者敲除等方式进行筛选;通过膜片钳技术观察电位变化；免疫学和影像学进行后续的蛋白结构、位置、表达水平的鉴定。其中免疫学中最常见的实验方法是免疫印迹（WB），但我们发现在用WB研究离子通道蛋白的过程中，经常结果不尽人意。鉴于离子通道蛋白的特性，要想WB一次成功，小优细节君整理了如下Tips，希望能够帮到您。
一、离子通道蛋白的主要特征：1.具有多重跨膜结构域2.分子量较大3.具有同源或异源多聚体4.结构复杂
图2CaV2.1跨膜结构域
二、离子通道蛋白WB实验的注意事项1、样品类型与蛋白特征样品制备是任何蛋白质印迹(WB)中至关重要的第一步。您使用的制备方案取决于您计划使用的样品类型和蛋白特征。对于细胞（贴壁/悬浮）样品，建议直接用Laemmli样品缓冲液，该方法将几乎所有细胞蛋白质释放到缓冲液中。如果后续要做IP，应该使用温和去垢剂（TritonX-或者NP-40）制备细胞系。对于组织样品，例如，从心脏、脑组织和脂肪组织中提取相同蛋白质的最佳方法不一定是相同的。通常，可以同时尝试两种裂解方案，比如“富集膜蛋白”或“常规制备”，最后选择对目的蛋白最合适的方案。此外，还需要考虑蛋白质的亚细胞定位（例如，质膜蛋白和核蛋白需要不同的样品制备方法），以及目标蛋白是否富含脂筏等特定微结构域（低温下脂筏能抵抗非离子去垢剂的抽提，超声有助于裂解过程）。当目的蛋白丰度很低时，还需要浓缩膜组分。蛋白具有多重跨膜结构域时，需要注意防止蛋白聚集或降解。
2、裂解液与裂解方式对组织或细胞样品进行裂解是为了释放目的蛋白、不同裂解缓冲液对蛋白溶解能力各不相同。现在裂解液市面上有很多，有RIPA，NP-40，TritonX-，SDS等，那我们如何去做选择呢。离子通道抗体厂家Alomone不建议使用RIPA进行裂解样品，RIPA往往会“破坏”膜蛋白，导致膜蛋白降解，特别不适合多重跨膜蛋白和易降解膜蛋白。另外，RIPA裂解液提取蛋白已被证实有10-30%的蛋白会丢失在不可溶组分中。Laemmli样品缓冲液释放更加全面。有些蛋白对于降解非常敏感，可以尝试不同的样品裂解液。
在裂解组织蛋白时，请注意全程需在冰上操作，裂解时需加入cocktail形式的蛋白酶体抑制剂。对于核蛋白和富含脂筏的，裂解时强烈建议超声处理，可以更大程度释放蛋白。组织匀浆时，避免使用匀浆珠，后者的放热可能导致蛋白损失。裂解后测完浓度，冻存于-80℃备用。
3、变性与上样变性时，将样品在Laemmli缓冲液中70–°C下加热10分钟。对于细胞，通常将其加热到℃。组织是更复杂的样本，加热到70℃可保护最“容易”降解的蛋白质。另外，对于多重跨膜蛋白，也不建议煮沸，可能会引起膜的聚集或者膜蛋白的降解，一般建议70℃10min或者37℃30min。对于可能形成多聚体的指标，要确保中Laemmli缓冲液中的还原剂有效，最好新鲜配制，DTT长时间会失效，可另外补充。如果样品在冰箱里存储一段时间，上样前可在70℃煮一下，有助于得到清晰的条带。细胞样品建议上样2–5x个细胞/泳道的裂解液。由于组织裂解时有许多杂质，上样80–g组织裂解液/泳道。
图3煮沸可能引起膜蛋白降解
4、电泳与转膜对于高分子量蛋白(HMW，分子量KD)，电泳时Tris-Glycine4–6%或Tris-Acetate3–8%凝胶是最佳选择，也可根据经验选择凝胶。HMW建议湿转，在4°C下以mA将蛋白质从凝胶转移到膜上20小时。注意此步骤至关重要，因为它决定了传输的有效性。较长的转移时间将提高HMW蛋白质转移的效率。5、封闭与抗体稀释一般产品说明会提供对应抗体的最佳的实验条件，当您实验遇到问题，需要优化实验时，请您优先参照产品说明进行操作。
三、常用实验protocol:1、使用Laemmli样品缓冲液制备细胞裂解液a.用冰冷的PBS清洗细胞板。重复3次。(对于悬浮细胞，清洗离心后加入裂解液)b.将板置于冰上并以5×细胞/ml样品缓冲液的比例加入预冷的样品缓冲液（62.5mMTris(pH6.8)、2%SDS、10%甘油和mMDTT）。c.用细胞刮刀刮下培养皿并将裂解液收集到微管中。d.将样品在°C下煮沸5分钟。e.对煮沸的样品进行超声处理5秒钟。f.将样品在4°C下以14,rpm的速度离心5分钟。g.将上清液转移到干净的微管中，并储存在-80°C直至进一步使用。
2、使用温和去垢剂制备细胞裂解液对于IP等应用，我们建议使用温和的去垢剂（如TritonX-或NP-40）进行细胞裂解。a.用冰冷的PBS清洗细胞板。重复3次。(对于悬浮细胞，清洗离心后加入裂解液)b.将板置于冰上并以5×个细胞/ml的比例加入预冷的IP裂解液。c.用细胞刮刀刮下培养皿并将裂解液收集到微管中。d.在4°C下将样品在微管中摇晃30分钟。e.将样品在4°C下以14,rpm的速度离心10分钟。f.小心地将透明上清液转移到干净的微管中。您可以将样品在-20°C下保存数月或立即与Laemmli样品缓冲液混合。
3、富集膜蛋白制备组织裂解液a.从动物身上取出感兴趣的组织，并在液氮中快速冷冻。将组织储存在-80°C直至进一步使用。b.将冷冻组织放入5倍体积预冷的富集膜蛋白裂解液中。。c.用polytron匀浆器匀浆组织。d.在4°C下以2,xg离心匀浆10分钟。丢弃大碎片。e.将上清液转移到干净的微管中，将沉淀重悬在2体积的富集膜蛋白裂解液中并重新匀浆。f.在4°C下以2,xg离心匀浆10分钟。将上清液与步骤e中的上清液混合。g.将上清液（来自步骤e和f）在4°C下以,xg离心1小时。h.丢弃上清液。用2倍体积的富集膜蛋白裂解液重悬沉淀（含有组织膜），并用polytron匀浆器短暂匀浆。i.使用Bradford方法测量蛋白质浓度。用富集膜蛋白裂解液将蛋白质浓度调整至4mg/ml。j.将蛋白质样品储存在-80°C直至进一步使用。
4、常规制备组织裂解液a.从动物身上取出感兴趣的组织/器官，并在液氮中快速冷冻。将组织/器官储存在-80°C直至进一步使用。b.将冷冻组织放入5倍体积预冷的常规组织裂解液中。c.用polytron匀浆器匀浆组织。d.在4°C下旋转样品30分钟。e.在4°C下以,xg离心匀浆1小时。f.将上清液转移到干净的管子中，并使用Bradford方法测量蛋白质浓度。使用常规组织裂解液将蛋白质浓度调整至4mg/ml。将裂解液储存在-80°C下直至进一步使用。
好的研究依赖于稳定高质量的试剂，Alomone离子通道专家（优宁维独家代理）多年来一直为离子通道研究提供稳定可靠的抗体,小分子化合物等。除了试剂,离子通道研究另一个不可或缺的工具就是—全自动膜片钳。
Reference1.CaterinaMJ,SchumacherMA,TominagaM,RosenTA,LevineJD,JuliusD.Thecapsaicinreceptor:aheat-activatedionchannelinthepainpathway.Nature::-.2.McKemyDD,NeuhausserWM,JuliusD.IdentificationofacoldreceptorrevealsageneralroleforTRPchannelsinthermosensation.Nature::52-.CosteB,MathurJ,SchmidtM,EarleyTJ,RanadeS,PetrusMJ,DubinAE,PatapoutianA.Piezo1andPiezo2areessential