USP-NF合成多肽原料药质量控制策略要点及探讨###
1.背景
多肽类药物具有生物活性高、特异性强、毒性反应弱、在体内不易产生聚集、与其他药物相互作用比较少、与体内受体亲和性高等优点,近年来被广泛用于肿瘤、代谢、心血管等疾病防治领域,是国内外制药企业研发热点之一。
合成多肽作为一类特殊的药物，其结构与蛋白质及小分子化药明显不同。同时，多肽药物的氨基酸序列、潜在的二级和三级结构以及制备工艺和质控要求等，与经典小分子化学药物相比有明显差异，具有多样性和复杂性，也可能是这个原因，国内外指导文件很少涉及此类品种。USP于年6月11日发布了“Qualityattributesofsyntheticpeptidedrugsubstances”[1]，对合成多肽药物的质量研究策略具有极大的指导意义，因此本文对该指导原则的重要内容进行提取和探讨。
2.主要内容
分别从以下几个方面对多肽药物相关杂质及产生因素进行分析：（1）起始物料，（2）多肽表征，（3）肽含量检测，（4）杂质。
2.1物料控制
合成多肽所用物料包含生产多肽原料药所需的SM、溶剂和试剂。起始物料（SM）是用于多肽原料药生产所用的原材料、中间体或活性成分和多肽片段等。通常，起始物料质量控制项目为鉴别和纯度，包括有关物质和对映异构体杂质，因其对多肽药品的质量有直接影响。SM质量控制可接受标准基于工艺开发、工艺验证的数据、历史批次的数据以及风险评估来确定。
多肽合成所用起始物料中的常见杂质如表1所示。
表1起始物料潜在杂质列表
2.2多肽表征方法
质量标准应全面反映产品的关键质量属性（CQA），USP多肽质量控制和表征分析常用的方法见表2。
表2多肽药物表征和质量控制常用检测方法汇总
2.3含量及肽含量
多肽原料药的含量一般以无水、无反离子计，通常使用色谱方法测定。当使用HPLC测定时，一般使用定量用标准品，如各药典标准品或自制的工作对照品。
传统的肽含量测定最早使用的方法为简单的质量平衡法，即以%减去样品中的水分、反离子、有关物质和其他杂质的含量。除此之外，还可使用N元素分析、凯氏定氮法或配置氮化学发光检测器（NCD）的色谱法。
氨基酸定量分析法也是肽含量测定的一种传统分析方法，但由于该方法操作过程相对复杂，因此测定结果可能不同。使用该方法计算肽含量时，将水解后样品的各氨基酸峰面积与氨基酸标准品峰面积比较，按外标法计算即得。另外，多肽水解方法应进行验证以确保回收率良好，并且只能选择稳定的回收率较好的氨基酸计算平均肽含量。
虽然定量核磁（qNMR）一般需要能与肽相关信号峰完全分离的内标物，但仍为肽含量测定的一种可选方法。qNMR的多功能性使得其可进行一些无合适紫外吸收基团的多肽分析，非常适合于多肽聚集的研究。
含有色氨酸（Trp）或酪氨酸（Tyr）的肽含量测定可通过测定UVnm处的吸光度而获得，摩尔吸收系数可基于多肽序列使用理论值计算，但应使用其他分析方法对测定结果进行验证。UV法测定肽含量是一种适用于频繁检测、线上实时测定和工艺过程中的简单快速分析方法。
2.4杂质
多肽原料药杂质谱依据所用生产工艺的不同可能具有显著差异，因此很难统一概述其杂质谱及控制策略。另外，由于多肽药物的生产工艺较小分子化药更为复杂，因此适用于小分子的杂质研究指导原则可能不适合于多肽。
2.4.1分类
USP原料药杂质研究指南中将杂质分为三类：有机杂质、无机杂质和残留溶剂。然而，从实际应用中，多肽杂质可分为多肽相关杂质和非多肽杂质。（1）多肽相关杂质，也称为“有关物质”，是指与目标分子结构相关的一类杂质。表3中对多肽相关杂质的分类、来源和鉴定方法进行了汇总，需要注意的是，此处仅对多肽中最为常见的杂质进行了汇总，实际研究过程中应不局限于此。（2）非多肽杂质，是指生产工艺过程中引入的与目标分子结构无关的一类杂质，包括残留的物料、试剂以及添加剂如催化剂和溶剂等，同时包括由此引入的反应副产物，具体见表4。
多肽纯度通常使用HPLC法测定，测定方法应能够将起始物料、工艺相关杂质和降解杂质均可分离，推荐使用多个分析方法，以尽可能将所有杂质均可检出。对于含有疏水性残基的多肽，优选RP-HPLC法；作为替代，可尝试使用离子交换色谱法或复合模式的高效液相色谱法。对于亲水性多肽，亲水相互作用色谱的固定相（HILIC柱）可能会获得较好的分离度，阴离子或阳离子交换色谱可能也会得到较好结果。另外，液相色谱-质谱联用法（LC-MS）对杂质的鉴定极为有效。
限度制定：为了合理制定多肽相关杂质的可接受限度，首先可将杂质进一步分为特定杂质和非特定杂质，特定杂质又可分为已知杂质和未知杂质，经过结构确证的杂质归为已知杂质，质控杂质及其限度依据毒理学研究、临床试验或基于杂质结构的科学评估而制定。已知杂质和未知杂质的限度均应在放行标准中进行规定。ICHQ3A（R2）新原料药中杂质研究指导原则中规定单一未知杂质的限度为0.10%或0.05%，但明确指出不适用于多肽产品；EP规定了更高的接受限度（0.5%）并被欧盟各成员国的药监机构所认可；其他监管部门如美国FDA则认为新多肽产品的未知杂质的控制限度应依据具体品种的特点具体分析。
2.4.2多肽相关杂质控制策略
多肽相关杂质的控制策略应基于工艺特点制定，充分考虑起始物料引入的杂质以及在多肽合成纯化过程中引入的杂质。可使用经过适当验证的过程控制分析程序来确保最终原料药的质量，特别是当某杂质含量较低无法通过放行方法准确测定时，应开发其他分析方法。
表3.多肽相关杂质的来源及常用分析方法
备注：异构体杂质的检测使用常规氨基酸手性柱通常无法直接检测，一般需要将多肽水解、衍生化后，使用手型气相/液相色谱柱分离，GC-MS或HPLC-MS分析，方法需经过验证。
2.4.3非多肽相关杂质控制策略
若生产工艺过程中使用的某个试剂在原料药中有残留的风险，则应将该溶剂残留定入质量标准，如在裂解和Fmoc脱保护中使用的三氟乙酸（TFA）。另一类潜在工艺杂质为元素杂质，ICHQ3D（R1）、元素杂质限度和元素杂质分析方法中描述了元素杂质的几个来源：合成过程中有意添加的催化剂残留、工艺设备或储存容器引入或起始物料引入。元素杂质的可接受限度依据毒理数据得到的每日允许暴露量（PDE）而确定，具体详见ICHQ3D（R1）的规定。
表4.非多肽相关杂质的来源及常用分析方法
3.结语
多肽药物不同于小分子药物，其结构复杂、合成步骤长、起始物料种类较多，因此合成多肽的质量控制应空分考虑不同原理的分析方法综合表征。（1）鉴别。质量标准中所用分析方法重点