年，实时荧光定量PCR（Real-timequantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）由美国AppliedBiosystems公司首先推出，所谓Real-timeqPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。
背景说明
年，实时荧光定量PCR（Real-timequantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）由美国AppliedBiosystems公司首先推出，所谓Real-timeqPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。其中，荧光染料也称DNA结合染料，目前常用的荧光染料主要有SYBRGreenI和TaqManProbe两种。其中SYBRGreenI能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBRGreenI几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。TaqManProbe是一种水解探针（5’Re-porter，3’Quencher），完整时不发光/水解后发光。每形成一条DNA链，就会水解一条探针，每水解一条探针，就会产生一个单位信号，信号强度与结合过探针的DNA分子总数目成正比。
两种荧光染料的优缺点
Real-timeqPCR技术解读
扩增曲线
在RT-qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在RT-qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
荧光阈值
为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。通常荧光阈值都是RT-qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。
循环阈值
循环阈值（Cyclethresholdvalve，Ct）即RT-qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数Ct值与荧光阈值有关。—般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小误差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。
计算公式
对于一个理想的RT-qPCR反应：Xn=X0×2n；对于一个非理想的RT-qPCR反应：Xn=X0×（l+E%）n，其中，n为扩增反应的循环次数，Xn为第n次循环后的产物量，X0为初始模板量，E%为扩增效率；在RT-qPCR中，在扩增产物达到荧光阈值线时：Xct=X0×（l+E%）ct，其中，X0为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在荧光阈值设定以后，Xct为一个常数；将上述公式两边取对数，并换算可得如下公式：lgX0=-lg（l+E%）ct+lgXct；即Ct值与lgX0呈负相关，据此即可计算出样本中所含的初始模板量。
服务流程
客户在线下单—确认订单/实验材料信息—提取RNA及反转录cDNA—引物设计—加样及上机—处理分析实验数据—整理实验报告
服务内容及说明
RT-qPCR的优点
特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，假阳性低。灵敏度高，RT-qPCR技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。准确性高、检测范围宽，由于荧光信号的产生和扩增产物呈线性对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0-拷贝/mL。操作简单、安全、无污染，扩增和检测可以在同一管内进行，不需要开盖，不易污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理也不需要担心放射性污染。速度快、通量高，可在2-3小时内完成96-个样品的定量分析。
适用场景
1、普通基因表达水平的检测：能够快速准确的定量出相关基因在不同组织或生命状态下的相对表达水平。2、基因拷贝数的检测：能够准确的定量出相关基因在染色体中的拷贝数，特别适用于检测转基因植物中外源T-DNA在植物基因组中的拷贝数。3、特殊RNA的转录水平检测：根据特殊RNA的结构，如microRNA、circRNA等，设计其特殊引物，如茎环结构引物、反向引物等，对这类RNA的转录水平进行定性、定量分析。
服务内容
1、从不同样品中提取核酸（DNA或RNA）；2、对核酸进行浓度及纯度评级；3、荧光定量PCR检测；①引物或探针的设计与合成；②相对定量或绝对定量的选择；③探针法或染料法的选择；④荧光定量PCR仪对目的基因的检测；⑤数据统计和分析（RNA浓度及质量检测报告、荧光定量PCR原始数据及优化数据、扩增曲线、溶解曲线、表达柱形图等）；4、预实验服务：根据客户提供的目的基因序列或NCBI序列号提供客户引物或探针，并筛选出最优化的引物或探针；5、正式实验服务：根据预实验筛选的引物或探针对所用样品进行荧光定量PCR的检测，并对结果进行统计和分析。
样品接收标准
实验信息
实验过程中客户可以随时登录管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。
结题标准
内参基因CT值正常（18-22之间）。具体问题具体分析。
实验交付内容
1、电子实验报告：填写实验报告模板中的各项信息，包含项目信息、靶基因引物序列、内参引物序列、相对表达量条形图，RNA电泳图；2、文件：原始下机文件、结果导出文件、相对表达量计算文件。
客户提供信息
1、请提供新鲜材料并确保鲜重2g/个样品或直接提供已纯化的核酸。如果目的基因表达量较低时，应尽量提供更高浓度的总RNA或DNA；2、液氮或干冰保存寄送的样品；冻存于Trizol中的样品。3、请提供已知的全长目标基因和参考基因序列（GeneBankAccessionNumber、GeneID）；4、请提供尽可能详细的背景资料：生物物种信息、DNA/RNA来源、丰度、同源性等；5、客户可以提供引物，没有引物的情况下，本公司帮助设计合成。备注：microRNA，circRNA等特殊RNA，提取加逆转录元/样
RNA评级办法
1、电泳法可以用于反转录的RNA质量标准为，28S和18S两条带完整，有无5S条带均可（5S条带存在的时候，就说明你提取的RNA质量非常棒），28S亮度大约是18S条带的两倍左右，无DNA污染。微量分光光度计RNA质检参数OD/OD、OD/OD的意义。、、、nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。A：测定其它碳源物质，如酚，糖类等。A：核酸的吸收峰，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。A：蛋白质的吸收峰。一般的，我们只看OD/OD（Ratio，R）在1.8~2.1范围内时，我们认为RNA中的蛋白污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R1.8时，溶液中的蛋白污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核苷酸了。纯RNA的OD/OD的比值为2.0。
RNA质量检验
RNA样品的品质检测一般分为总量、纯度与完整性三大项。总量：微量分光光度计测nm吸收值计算。纯度：微量分光光度计测nm/nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；nm/nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。完整性：电泳法检测28S、18S、5S条带。
植物组织样品取样建议
核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材环境等因素息息相关，为保障获得相对较高质量的核酸，请务必按照以下指导原则准备样本。1、液氮速冻法①植物材料取材后用清水将材料表面的灰尘及泥土冲洗干净，吸干材料表面的液体。②植物组织样品取样重量≥mg，将样品分割成50~mg左右的小块，放入干净的离心管或带螺纹旋盖的保存管中，立即使用液氮速冻。③转移至-80℃低温保存，送样时选择干冰运输寄送。2、商用核酸保护液保存法由于植物含细胞壁，从已有经验看来，RNAlater之类的核酸保护液难以充分渗透，对于植物样品提取效果较差，不建议使用；若条件有限，只能使用核酸保护液，请严格按照相应的产品使用说明操作。尽量使组织块尺寸保持在5mm左右，过小不利于样本收集，过大则保护液不能均匀渗透到组织细胞内。对于多糖多酚丰富的植物样本（特别是木本类植物），需暗处理24-48小时后再取样。
1、组织速冻时间：组织离体后，胞内核酸便开始降解，尤其是RNA，故采集时，目的组织离体后，需立即速冻，建议5min内完成，越快越好。2、组织送样量：送样量过少或过多均不利于提取实验，下限为建议量的一半，上限为建议量的3倍。3、组织保存管的选择：所有组织样品务必使用离心管或螺纹管保存，切勿直接装入密封袋保存（低温冻脆易破裂，导致样品泄露，交叉污染）。4、组织样品保存方法选择：首选液氮速冻；没有液氮条件的，可直接放入-80℃冰箱冻存。5、冻融组织：组织冻存后，一旦冻融，RNA降解概率大于80%，几乎不可能提取成功，此类组织不建议送样。送样前确保组织未发生过冻融情况。6、对于同一个组织样品需要同时提取DNA和RNA的，请务必分成两管分批次送样。