文章简介
英文题目：Pu-erhteaincreasesthemetaboliteCinnabarinicacidtoimprovecircadianrhythmdisorder-inducedobesity
中文题目：普洱茶增加代谢物朱砂精酸以改善昼夜节律紊乱诱发的肥胖
期刊名：FoodChemistry
发表时间：年6月16日
IF：9.
作者单位：西南大学
DOI号：10./j.foodchem..
组学技术：非靶向代谢组学+微生物多样性+TMT蛋白组学+靶向短链脂肪酸代谢
样品来源：小鼠血清；小鼠脂肪组织；小鼠粪便
研究背景
昼夜节律是生物体内生理或行为特征的周期性或节律性变化，调节身体的物质代谢和能量循环。而肥胖是昼夜节律紊乱（CRD）介导的代谢紊乱综合征之一。普洱茶（RPT）是治疗CRD的一种可行的饮食干预方法，在作者之前的研究中已经证明RPT可能通过调节胆汁酸介导的肝肠循环来缓解CRD引起的代谢综合征，但其对CRD诱导的肥胖的影响仍不清楚。鉴于上述情况，作者通过分析CRD诱导的小鼠WAT和BAT组织中的脂滴形成和脂解相关蛋白，阐明了RPT改善CRD诱导小鼠脂肪生成的机制。此外，结合非靶向代谢组学和体外/体内实验，确定了RPT血清中的关键代谢产物，以改善CRD诱导的小鼠脂肪生成。然后，作者进一步采用TMT蛋白质组学和组织蛋白表达分析用于推测关键代谢物的潜在受体。为了进一步研究关键代谢产物改善CRD诱导小鼠肥胖的其他途径，作者还采用微生物多样性测序技术和靶向短链脂肪酸代谢研究了不同处理小鼠的肠道微生物及其代谢产物的变化。
研究结果
1.普洱茶改善CRD诱导小鼠的糖脂和氮代谢
动物实验设计示意图如图1A所示。具体的说，5至6周龄C57BL/6J小鼠在正常光照环境（LD12:12）中喂养，并分别给予水（CK-W）和0.25%RPT（CK-T）。在30天结束时，将CK-W和CK-T随机分为两组，即CK-W、CK-T、CR-W和CR-T，后续按照CRD方案进行。与CK-W和CR-W相比，RPT显著降低了小鼠的体重（图1B），同时具有更高的膳食摄入量（图1C）。此外，随着CRD时间的延长，CR-W小鼠出现更严重的脱发，而RPT缓解了这一趋势（图1D）。
接下来，作者评估了CRD对糖脂和氮代谢的影响。小鼠肝脏的油红O染色（ORO）显示，肝脏中的脂肪沉积量与CRD处理的持续时间呈正相关（图1E），并且RPT在一定程度上抑制了脂肪积累（图1F）。HE染色也证实了脂肪积累的时间依赖性增加。与CR-T相比，CR-W肝脏表现出更明显的细胞空泡化和炎性浸润，呈泡状外观。此外，作者还测定了小鼠血清中的相关因子。CRD增加胰岛素抵抗并增加TG和TCHO水平（图1G-I）。CR-T显示出相对稳定的胰岛素水平，与CR-W相比，TG和TCHO水平虽然有所增加，但显著降低。在氮代谢方面，RPT显著抑制CRD诱导的氮代谢失衡（图1J-K），降低血清总胆汁酸水平，增加粪便中胆汁酸水平（图1L-M）。与HE结果一致，CR-W处理的GOT和GPT随着CRD持续时间的增加而逐渐增加，表现出比CR-T更严重的肝损伤（图1N-O）。
图1普洱茶改善CRD诱导小鼠的糖脂和氮代谢
2.普洱茶可减少CRD诱导小鼠的脂肪沉积
在上述结果中，作者发现CRD破坏了小鼠的糖脂代谢，导致肥胖的发展，而RPT可以削弱这一趋势。肥胖的发生与脂肪沉积有关。因此，我们在三周和六周对CRD处理的小鼠进行了热成像（图1P），以研究CRD对脂肪组织的影响。结果表明，与CR-T处理组相比，CR-W具有更高的腹部脂肪（白色脂肪组织，WAT）信号，并且在第六周高于第三周。与CR-W不同，CR-T具有更高的肩胛脂肪（棕色脂肪组织，BAT）信号。作者推测CRD增加了小鼠体内WAT的积累。相反，RPT在增强BAT功能的同时减少了WAT积累，从而抑制了CRD诱发肥胖的发展。
为了进一步研究CRD诱导的脂肪组织的变化，作者收集了不同时期小鼠的CRD诱导WAT和BAT。与CR-T相比，CR-W处理小鼠的BAT严重漂白并被白色脂肪包裹。RPT处理组的WAT生长率明显低于CR-W处理组（图2A）。如HE染色和WAT/体重结果所证实（图2B-C），从CRD诱导的第6周起，CR-T的WAT显著低于CR-W。随着CRD时间的增加，CR-W组小鼠的WAT和BAT以肉眼可见的速度充满脂滴。CR-T处理组对BAT内的脂滴具有更好的维持效果，尽管WAT也因脂滴而逐渐扩大。随后，作者使用WB分析和q-PCR分析了小鼠中WAT和BAT相关蛋白和基因的表达。结果表明，在CR-W处理组中，WAT内脂滴融合蛋白的表达以CRD时间依赖性方式增加（图2D）。RPT显著降低了WAT内的脂滴融合率，尽管在第10周时Plin1和Fsp27更显著地增加。RPT减少了BAT的漂白，如BAT内Rab8a、Fsp27和Plin1蛋白表达的下调所证明（图2E）。RPT增加了BAT的脂解速率，维持了BAT发育和成熟，并促进了其产热蛋白UCP1、CKB和ATGL的表达（图2F）。此外，RPT增加了WAT脂解基因和BAT分化相关基因的表达（图2G）。
基于以上，作者发现CRD通过两种主要方式导致小鼠肥胖：首先，它促进WAT细胞中脂滴的融合，导致脂肪沉积。其次，它干扰了BAT的发育和成熟，降低了BAT的脂解速率，并促进了BAT的漂白。相反，RPT通过促进BAT的脂解产热，减轻了WAT内的脂质沉积，并显著降低了CRD诱发肥胖的风险。为了进一步研究RPT对CRD诱导的肥胖的干预机制，作者进行了非靶向代谢组学分析，以确定RPT摄入后的关键代谢产物。
图2普洱茶改善CRD介导小鼠的肥胖
3.普洱茶改变CRD诱导小鼠的血清代谢
作者对CRD第10周小鼠（CR-10-W和CR-10-T）的血清样品进行了非靶向代谢组学分析。根据PCA和OPLS-DA分析，CR-W和CR-T治疗组之间的代谢谱明显分开（图3A-B）。令人兴奋的是，代谢物组成主要集中于脂质和肽（图3C），它们与脂肪生成有关。KEGG功能途径分类的结果表明，代谢（脂质代谢和氨基酸代谢）、器官系统（消化系统）和人类疾病（癌症：概述）最丰富，这再次证实CRD干扰消化功能，扰乱脂质代谢，并增加癌症发展的风险。此外，对代谢物富集途径的分析（图3D）表明，咖啡因代谢、嘧啶代谢、ABC转运体、精氨酸生物合成和色氨酸代谢在CR-T中显著富集（图3E）。
此外，作者分析了CR-T和CR-W之间的差异代谢物（图3F）。通过筛选VIP5的差异代谢物，结果表明，除朱砂精酸（CA）外，大多数代谢物都存在于咖啡因代谢途径中。因此，我们使用排名前三位的差异代谢物，以1,7-二甲基尿酸（DA）和3-（甲硫基）-1-丙醇（MP）作为咖啡因代谢的代表性产物，探索RPT对CRD介导的肥胖的潜在关键代谢物。
图3普洱茶改变CRD诱导小鼠的血清代谢
3.朱砂酸是普洱茶介导的关键代谢产物且改善CRD诱导的肥胖
为了确定上述三种代谢物是否在抑制脂滴融合和促进脂肪生成中起关键作用，作者进一步研究了三种代谢产物对棕色脂肪细胞（C3H10T1/2）分化诱导的影响。ORO结果表明，与DA和MP相比，CA处理的棕色脂肪细胞显示出更小和更致密的脂滴（图4A）。DA、MP和CK处理组大脂滴显著增加。作者推测，在棕色脂肪细胞的诱导过程中，CA可能进一步增加了细胞的能量消耗。WB实验的结果证实了上述推测（图4B）。结果表明，随着处理浓度的增加，CA处理组（UCP1、CKB和Pparα）的产热蛋白表达显著激活，DA处理组略有增加，MP处理组无显著性。此外，脂滴融合蛋白表达结果表明，与MP处理（Rab8a、Fsp27和Plin1）相比，CA和DA均显著下调蛋白表达，其中CA处理最为显著。因此，总而言之，作者初步确定CA是减少RPT中CRD介导的肥胖的可能关键代谢物。
为了进一步阐明CA在体内是否具有类似的作用，作者在CRD治疗期间向小鼠腹腔内施用CA（图4C）。与CR-W相比，CA显著减缓了CRD和饮食诱导的体重增加（图4D-E）。
CA处理减少了附睾中的白色脂肪沉积，并抑制了棕色脂肪的漂白（图4F-G）。同时，HE和ORO染色结果进一步证明CA不仅对脂肪组织有作用，而且有助于抑制肝脏脂肪沉积和减少肝脏炎症浸润。脂肪组织WB结果表明，CA显著增加了BAT和WAT中产热蛋白的表达，并降低了BAT以及WAT中脂滴融合蛋白的表达（图4H-I），其效果与RPT处理类似。此外，代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）是CA的靶受体，在RPT和CA治疗后表达增加（以CA剂量依赖性方式）。
图4朱砂精酸是普洱茶改善CRD介导的肥胖的关键代谢产物
探索潜在受体
在小鼠中，RPT和CA对CRD诱导的脂肪组织均表现出显著的促脂肪分解和致热反应，这提高了作者对研究其潜在靶受体的兴趣。因此，作者采用TMT蛋白组学技术分析了CRD-W、CRD-T和CRD-CAH处理小鼠BAT组织中的蛋白质表达。结果表明，CRD-W处理的小鼠和其他两组之间的蛋白质表达存在显著差异，而CRD-T和CRD-CAH处理的小鼠之间存在一些相似性（图5A）。然后，作者对蛋白质进行了两次单独的比较分析，结果显示：CRD-CAH与CRD-T中个上调和个下调；CRD-T组与CRD-W组分别上调35例和下调6例；CRD-CAH与CRD-W中37个上调和12个下调。进一步筛选在CRD-T和CRD-CAH中上调的蛋白质，相对于CRD-W共产生8种蛋白质（图5B-E）。此外，作者对差异表达蛋白进行了功能富集分析。结果表明，CRD-CAH和CR-T处理组均显著促进花生四烯酸代谢途径蛋白的表达。相对于CRD-T和CRD-W，CRD-CAH显著增加了蛋白质消化和吸收途径、ECM受体相互作用和粘着斑途径上的蛋白表达（图5F-H）。这些结果再次证明了RPT和CA在改善CRD介导的脂质积聚中的关键作用。
图5CA和普洱茶改变CRD介导小鼠BAT蛋白表达
朱砂酸改变CRD诱导的小鼠肠道微生物和短链脂肪酸
目前尚不清楚CA是否能改善CRD处理小鼠的肠道微生物。结果表明，RPT显著增加了CRD处理小鼠的肠道微生物种群的丰度（图6A），而CRD-CAH并不显著。基于ANOSIM的主成分分析（PCA）结果表明，在属水平（图6B），RPT组（CR_3_T和CR_6_T）与饮用水组（CR_3-W和CR-6-W）之间存在显著差异。CRD-CAH与CK-T一致，表明CA处理的肠道微生物与RPT处理相当。在门水平上（图6C），不同处理组的物种组成相似，但CRD-CAH显著增加了Firmicutes、Lactobacillus和Eubacterium的相对丰度。此外，与CR-W（CR_3_T和CR_6_T）相比，RPT处理对肠道微生物群的组成具有更好的维持和稳定作用。由于CRD处理，RPT处理增加了Turicibacter、Akkermansia、Ileibacterium、Faecalibaculum和Bifidobacterium的富集，并减少了Muribaculaceae、Lachnospiraceae、Desulfovibrio和Clostridium的富集。总的来说，RPT和CA处理的CRD小鼠的微生物变化在门和属水平上表现出相同的趋势。
上述结果表明，RPT处理的CRD诱导小鼠不仅增加了代谢物CA的含量，而且CA可以直接调节CRD处理小鼠的肠道微生物组成，这与RPT表现出类似的趋势。为了进一步证明钙是否能调节其他微生物代谢产物，作者测量了短链脂肪酸的含量。结果表明，CRD降低了小鼠中短链脂肪酸的含量，随着诱导时间的增加而降低（图6E）。然而，RPT和CA显著缓解了这一趋势，尤其是在乙酸、丁酸和戊酸水平达到显著水平时。值得注意的是，在丁酸和戊酸含量的结果中，CRD-CAH高于RPT治疗组。这些结果在一定程度上评估了CA在缓解CRD中的作用。
图6朱砂精酸和普洱茶改变了CRD介导小鼠肠道微生物及其代谢产物的组成
研究结论
该研究使用健康小鼠作为实验对象，通过多组学串联分析探讨RPT对CRD介导的脂质积聚的潜在机制，最终揭示RPT可能通过促进CA增加，靶向脂肪细胞受体蛋白，以及调节肠道微生物和短链脂肪酸的产生，从而抑制CRD诱导的肥胖。此外，该研究还发现经RPT和CA治疗后，mGlur4蛋白在脂肪组织中高度表达。阐明mGluR4蛋白在糖脂代谢中的作用及其依赖性表达机制将有助于拓宽RPT在降脂中的途径，这将为深入探讨mGluR4与RPT之间的作用关系提供支持。